Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme
CAD trên ngân hàng gen quốc tế
2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter.
2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ
2.3.4. Tổng hợp cDNA
2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng
PCR
2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng
2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error!
Bookmark not defined.
2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen.
2.2.9. Phƣơng pháp Gateway.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA bạch đàn
3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR
3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD
3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp
3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5.
3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp.
3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2
3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của
promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T
Blake
3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl
alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19
Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết 21
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA 22
Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23
Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23
Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 24
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR 24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 26
Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid 28
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt 29
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR 29
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối 31
Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR 32
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR 33
Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 34
Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi 35
Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R
52
Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp
pBENDER/CCR bằng XhoI 64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin ………………………………… 9
Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật 10
Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) 15
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 25
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT 26
Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 30
Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTR
TM
/D-TOPO
31
Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER 32
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn 34
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 35
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 36
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch 37
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37
Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 39
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41
Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD1 43
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD2 44
Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và
CAD2 45
Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii 46
Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………… 48
Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% 51
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA 51
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 53
Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% 54
Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR 56
Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả
biến E.Coli DH5 56
Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR 58
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR
59
Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R
61
Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 61
Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI 62
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng
Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu
Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến
quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ sinh học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN
cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động
viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn
này.
Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009
Học viên
Lê Phương Dung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
cDNA Complementary DNA
DNA Deoxyribonucleic Acid
DEPC Diethyl pyrocarbonate
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid
g/l Gam/lít
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
Kb Kilobase
kDa KiloDalton
LB Luria Bertani
mg/l miligam/lít
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
SDS Sodium dodecyl sulphate
TAE Tris - Acetic acide - EDTA
Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase
TE Tris – EDTA
v/p vòng/phút
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TRONG NƯỚC
1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp, Hà
Nội, tr. 311- 317.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112.
3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường
công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100.
4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn
Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ,
Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp
Việt Nam.
5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực
vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221.
6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã
rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến
sĩ sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24trang.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
7. A. Baghdady, A S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon, S.
Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in
lignifying cells during primary and secondary xylem formation in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–683.
8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin
modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic
manipulations/mutations on lignification and vascular integrity.
Phytochemistry 61 (2002) 221–294.
9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©
technology.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto
D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol
dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and
expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.
11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in
Lignin Formation in Wood. NABC Report.
12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4.
13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima
P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol
dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular
Biology. 4(27): 651-667.
14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B.
Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes,
cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2
(CAD2). Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.
15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction
procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.
3(9): 262-266.
16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau
A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J.
(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,
regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant
Journal. 43(4): 553-567.
17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),
Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in
transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C.
(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of
promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325.
19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai
C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes
cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature
Biotechnology. 17: 808-812.
20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H.
Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt,
Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic
Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl
CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392
21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L.,
Davin L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of
the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in
Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences.
101:1455-1460.
22. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and
Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J.
(2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii
cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among
woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497-
509.
24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M.
Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin,
Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét